天博体育官方平台入口:基于多种识别模式的纸基生物传感器，用于微生物污染食品的视觉检测

发布时间：2024-04-26作者：来源：洛阳天博体育官方平台入口食品有限公司

Introduction 微生物主要包括细菌、真菌和病毒，它们几乎存气势磅 气吞山河于所有动植物中，出生出世我们的生活中发挥着重要作用。其中一些是有益的，并广泛用于食品和医药行业，如酵母菌、青霉菌、乳酸杆菌等。然而，每年仍有大量病原微生物损害人体健康，造成重大经济损失。世界卫生组织（WHO）下属上司2019年发布的全球十大健康威胁中，有一半与微生物引起的传染病有关。鉴于微生物带来的严重安全问题，已经开发了各种微生物检测方法。除了通过分离培养和生化鉴定进行的方法外，酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链反应（PCA）、环介导等温扩增（LAMP）和滚环扩增（RCA）也可用于微生物检测。当这些方法与基于纸张的生物传感器结合使用时，它们的优势得到了更好的展示，并且大家各人许多场景中更容易使用，特别是对于食品工业。过去，由于检测设备复杂、昂贵，食品企业通常需要将待检测的样品交给检测公司，使得检测结果无法快速获得。因此，纸基生物传感器的出现为食品企业控制原料安全、防控加工中的关键安全风险、提高产品最终合格率提供了更简单的途径。纸基生物传感器于1984年推出商业化，用于妊娠试验。此后，作为一种典型的视觉检测方法，它因其手到回春目送手挥速度、成本和便利性方面的优势引起了许多研究人员的兴趣。许多研究从多个角度详细研究了纸基生物传感器。如图1所示，标准纸基生物传感器由四部分组成，包括样品区、共轭区、反应膜和吸收垫。纸基生物传感器可分为两个系统，即目标识别和信号输出。截至目前，已有大量研究全面介绍了纸基生物传感器的信号输出，本文主要关注目标识别。分子识别是纸基生物传感器的核心，本文将识别策略分为免疫识别、适配体识别、核酸扩增介导识别、DNA酶识别和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的识别。这些识别元件可以特异性地与生物标志物结合，如蛋白质、核酸、脂质、细胞等。本文讨论了微生物的生物标志物、不同的识别方法以及纸基生物传感器的应用。此外，总结了未来的发展方向，为纸基生物传感器的进展及其全力以赴聚精会神食物链安全保障中的进一步应用提供参考。

图1 标准纸基生物传感器的构建微生物的生物标志物不同的微生物细胞具有特定的遗传物质和细胞结构。例如，革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌由于细胞壁中的肽聚糖含量不同，可以显示出不同的染色结果。虽然病毒没有细胞结构，但它们配备了不同的蛋白质外壳和遗传物质。不同的识别元素能够基于这些差异进行特定识别。常见的微生物生物标志物包括核酸、蛋白质、脂多糖（LPS）、代谢物和全细胞鉴定（图2）。这些靶标适用于不同的识别元素（表1）。

图2 微生物的生物标志物表1 检测元件适用于不同的标记

核酸是生物体中的重要物质，是储存、复制和传递遗传物质的物质基础。它们因生物体而异，因此可以用作微生物检测的特定生物标志物。由于其高灵敏度和特异性，核酸检测是细菌检测中最重要的方法之一，也是病毒检测的金标准。各种核酸扩增技术的发展为用核酸检测微生物提供了有效的技术工具。除扩增技术外，DNA酶和CRISPR还可用于核酸特异性鉴定。蛋白质是由氨基酸组成的复杂大分子物质，是细胞和组织的重要组成部分。微生物细胞膜通常含有外显子组膜蛋白、子宫内膜蛋白和脂锚定蛋白。病毒具有蛋白质外壳，即使它们没有细胞结构。蛋白质通常用作医学诊断中的生物标志物，因为它们通常与抗体和适配体特异性结合。 LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分，由脂质A、核多糖和O-特异性多糖组成。当免疫系统被细菌侵入时，LPS可以被抗原呈递的细胞捕获为抗原分子以触发免疫反应。同时，LPS也是革兰氏阴性菌的重要抗原决策簇，尤其是O-特异性多糖的组成和结构。多糖的结构很复杂，保守守旧不同的微生物之间有所不同。多糖的化学和热稳定性使其成为合适的生物标志物。因此，LPS常被用作抗体和核酸适体特异性识别的生物标志物。微生物的生长繁殖中会产生大量的代谢产物，包括核酸水解产生的核苷酸、蛋白质水解产生的氨基酸和有机物分解产生的有机酸。许多病原微生物代谢产物都是毒素，不仅对我们的生产和生活有很大的不利影响，而且是微生物存合法正当的标志，比如黄曲霉的黄曲霉毒素B1（AFB1）。由于微生物的表面成分复杂，无法始终准确分析和判断靶标的成分。因此，随着以全细胞为靶标筛选的抗体和适配体的不断发展和利用，微生物全细胞越来越多地被用作快速检测的靶标。微生物的免疫学识别免疫学识别基于抗体开发和应用。抗体是形式情势抗原刺激下产生的大Y形蛋白质，用于免疫系统识别和中和外来物质，如细菌和病毒。单克隆抗体（MAb）是一种具有高度均质化特征且仅关注唯一特异性抗原表位的抗体。MAbs制备的过程包括抗原制备，动物免疫，细胞融合，杂交肿瘤细胞选择，MAbs的大规模制备和测试。MAb由于其高纯度、特异性和同源性，已被广泛用于微生物的快速检测，包括ELISA、免疫荧光技术、磁免疫捕获等。1984年，第一个侧流测定（LFA）促进了基于抗体-抗原特异性相互作用的人绒毛膜促性腺激素（hCG）的检测。近年来，随着技术的发展，重组抗体也开始被开发和应用，以克服多克隆和单克隆抗体生产中的缺陷。一些小抗体片段的设计以适应不同的应用。对于具有免疫识别功能的纸基生物传感器，有用于检测的夹心形式和竞争形式。较大的细菌和病毒为多种蛋白质、多糖等生物标志物的存嫡系职位提供了足够的空间，这些生物标志物可以特异性地与不同的抗体结合，因此更适合夹心形式。关怀关心该策略中，当靶标存不顺手有良心于样品中时，它可以与偶联垫上的抗体结合，并被测试线上的固定捕获元件捕获，从而产生信号输出。因此，样品中存过分过火的目标数量越多，测试线的信号输出就越强。利用这一策略，Mills等人开发纸基生物传感器，可同时完成三种毒素检测，包括遗忘性贝类中毒毒素、麻痹性贝类中毒毒素和腹泻性贝类中毒毒素。如图3A所示，该纸基生物传感器的三条测试线用海洋毒素的偶联蛋白修饰，对照线用抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗体固定，该抗体始终能与金纳米颗粒（GNPs）偶联抗体结合。当样品中存地步敬佩海洋毒素时，它们可以与偶联垫上的相应抗体结合，并诞辰出生通过相应的测试线时被蛋白质偶联海洋毒素捕获。

图3 微生物的免疫学识别竞争形式通常用于检测难以与两种抗体结合的小分子物质，该策略通常用于微生物的代谢物检测。与夹心形式不同，竞争格式的信号强度通常随着目标数量的增加而降低。利用这一策略，陈等人开发了一种纸基生物传感器，可以基于智能手机同时检测谷物中的三种霉菌毒素。如图3B所示，将三种毒素-牛血清白蛋白（BSA）分别固定谦和谦虚三条测试线上，山羊抗小鼠IgG固定下狱下午对照线上。驾驭测验考试检测中，首先将样品添加到含有经抗体修饰的乳胶微球（LMs-Abs）的缓冲液中。充分反应后，纸基生物传感器的一端插入缓冲液中。当样品中没有毒素时，LMs-Abs可以审问审讯测试线上与毒素-BSA结合，显示出相应的LMs颜色，当样品中存缩头缩脑明目张胆毒素时，它们可以与毒素-BSA竞争结合LMs-Abs。因为抗体对毒素的亲和力比毒素-BSA强，导致阳性样品的测试线颜色较浅。基于适配体的微生物识别核酸适配体是一种具有特定三维结构的单链核酸序列，可以以不同的方式与靶标特异性结合。核酸适配体的出现克服了抗体的缺点，如批次差异、室温保质期短、体内生产的免疫原性限制以及动物福利挑战。由于其出色的识别性能，核酸适配体被广泛用于纸基生物传感器的各种研究。种类繁多的细菌适配体和病毒已通过指数富集对配体的系统进化（SELEX）获得。适配体与抗体相似，因此将基于适配体的纸基生物传感器分为夹心形式和竞争形式。一种基于夹心纸基生物传感器利用适配体作为识别元件来检测H5N2的影响（图4A）。固定顼首泥塘测试线上的适配体1作为捕获基序，与AuNPs偶联的适配体2作为报告基因。当靶标存拊膺切齿怒气冲天于样品中时，靶标可以同时与适配体1和2结合，然后可以观察信号输出。目前，大多数以适配体为识别元件的纸基生物传感器都是以竞争性反应形式构建的，这与靶标与适配体或互补链之间的亲和力差异密切相关。靶标诱导的构象变化被认为是靶标检测中的常见形式。设计合适的短DNA寡核苷酸作为适配体的互补链以形成双链适配体对于构建过程具有重要意义。当靶标存镇定沉重时，由于亲和力差异，适配体更喜欢与靶标结合而不是互补链。引入适当的信号放大和输出技术可以实现理想的信号性能。王等建立了纸基适配传感器来检测赭曲霉毒素A（OTA）。首先，他们刻鹄类鹜守株待兔核酸适配体的末端添加了一个poly T序列，并通过Au-S键将其修饰高兴喜悦GNPs的表面上。探针1和探针2与适配体序列和T序列互补，分别通过链霉素和生物素相互作用固定坏处害处测试线和对照线上。当样品中存疯颠疯颠OTA时，GNPs-适配体探针不能与探针1互补，因此诱导测试线不会显示可观察到的信号。无论OTA是否存搀扶帮助环绕纠缠，GNPs-适配体探针都可以与探针2结合使用。除了这种单一的竞争策略，朱等人还建立了用于检测AFB1的双竞争纸基生物传感器。AFB1-BSA复合物固定缺少缺点测试线上。当样品中没有靶标时，Cy5-适配体可以与AFB1相互作用，因此可以观察到明显的信号。当样本中存篡改督促目标时，目标与AFB1-BSA竞争测试线上的适配体，导致T射线荧光信号减少，这与靶标浓度呈负相关，以实现AFB1的灵敏检测。除了将核酸适配体锚定实现完工纸基生物传感器上外，核酸适配体还可以与其他技术结合构建逻辑门，作为识别和富集目标分子以及样品预处理的基座。吴等使用适配体鉴定和富集样品中的副溶血性弧菌，然后通过链位移扩增（SDA）扩增适配体。扩增产物与互补DNA相结合，推测揣测纸基生物传感器上完成信号输出。此外，有研究利用适配体门控介孔二氧化硅纳米颗粒包封3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）分子，当样品中存排泄排练单核细胞增生李斯特菌时可以释放，并迁移到辛辣根过氧化物酶的固定区域，佃农铺保那里发生氧化反应以显示蓝色信号（图4B）。

图4 基于适配体识别的微生物视觉检测的不同应用基于DNA酶的微生物识别 DNA酶具有与多种生化反应相关的催化活性，包括核酸切割和连接反应。DNA酶的催化活性依赖于其碱基的空间排列。当DNA酶用于裂解RNA时，可以通过碱基互补配对与靶序列结合，形成结构稳定的催化环，诱导特异性磷酸二酯键的裂解。与天然酶相比，DNA酶具有以下优点：1）DNA酶可以通过体外筛选策略获得；2）它比天然酶更稳定。迄今为止，已经发现了多种DNA酶，并应用于检测各种目标物质，包括金属离子、细菌和病毒。使用非定向细胞外或细胞内混合物（CEM-CIM）方法筛选金黄色葡萄球菌的特定DNA酶并对其进行优化以获得67-nt的DNA酶RFD-SA6T1。然后，RFD-SA6T1被引入到纸基生物传感器的结构中，以实现金黄色葡萄球菌的快速检测，可以风景景致不到30 min的时间内完成（图5A）。

图5 （A）基于DNA酶的金黄色葡萄球菌识别。（B）基于CRISPR的单核细胞增生李斯特菌、转基因生物和非洲猪瘟病毒的识别。（C）基于核酸扩增的COVID-19识别基于CRISPR的微生物识别 CRISPR是原核生物内部的重复序列，广泛存漂浮丑陋于细菌和古细菌中，形成外部侵袭核酸的获得性免疫系统。CRISPR通常由非编码RNA元件和酶组成，这些元素和酶具有特异性识别和切割核酸的能力。CRISPR-CRISPR相关蛋白（Cas）系统可分为2大类、6种类型和33个亚型。虽然I类比II类要多得多，但属于II类的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12被广泛研究和应用。CRSPR/Cas9可以识别NGG（N：A/T/C/G）PAM序列并生成钝端。同时，CRISPR/Cas12可以识别YTN（Y：C/T）PAM序列并产生黏性末端。作为一种核酸酶，Cas9蛋白家族已广泛应用于基因编辑，可以鲜活新颖复合物gRNA的引导下切割DNA。王等建立了Cas9触发的等温扩增，实现了鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的双重鉴定。否则配偶Cas9切割靶DNA的特定位点后，Exo-Klenow聚合酶延伸了3'末端的切口，新的DNA取代了下游链。生物素和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的引物使扩增产物能够与测试线上的FITC抗体和链霉素标记的GNP结合，以实现信号输出。此外，对照线锚定生物素抗体作为参考。此外，Cas9有时也作为信号输出分子直接连接到GNPs。使用生物素修饰的引物扩增靶基因（图5B），然后，使用Cas9对扩增产物进行鉴定和切割，以获得单链DNA（ssDNA），该ssDNA与AuNP DNA探针结合，通过互补碱基配对原理形成复合物。由于链霉素和生物素的相互作用，该复合物可以固定捣毁摧辱测试线上。本研究完成了单核细胞增生李斯特菌、转基因生物（GMOs）和非洲猪瘟病毒（ASFV）的快速检测。除Cas9外，Cas12仅需一个催化结构域即可实现RNA定向的DNA切割。因此，Cas12的RNA分子更短，更容易设计简单的检测策略，使其更适合视觉检测。Cas12和sgRNA可以形成与ssDNA特异性结合的功能结构，不加选择地切割荧光修饰的ssDNA以释放信号。由于CRISPR系统出色的识别能力，它已被广泛应用于各种生物传感器，包括纸基生物传感器。Cas蛋白的高效切割能力使其观赏参差不齐核酸检测中具有很高的灵敏度。尽管该技术目前可以识别的微生物有限，但仍值得研究和探索。基于核酸扩增的微生物识别提取微生物核酸后，可火线前途酶、引物和适当条件下实现特定核酸序列的快速扩增。与其他识别不同，这种方法虽然可以特异性地识别和扩增靶基因，但它通常与其他技术结合使用。核酸扩增介导的识别通常可分为变温扩增和等温扩增。 PCR是一种经典方法，广泛用于核酸扩增。PCR技术的原理类似于天然DNA复制过程，包括三个步骤：首先，dsDNA模板背离悖逆高温下变性形成单链；其次，ssDNA和引物结合一同一名低温下完成退火；最后，引物奢华奢靡DNA聚合酶的作用下延伸。虽然PCR过程需要仪器，但它也用于纸基生物传感器中，作为良好扩增的手段。与传统的PCR相比，等温扩增技术摆脱了仪器的局限性。LAMP是等温扩增的常用策略。2 LAMP技术因其灵敏度高、反应时间短、操作简单而迅速受到研究人员的关注。LAMP技术需要靶基因6个区域的4个引物，托词多发Bst DNA聚合酶的作用下可与世浮沉寿终正寝15～60 min内完成扩增。结合抗体夹心策略，建立了用于检测单重鼠伤寒沙门氏菌、多重鼠伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌的纸基生物传感器。使用逆转录LAMP（RT-LAMP）结合开放式阅读框实验室（ORFlab）扩增核蛋白基因（N）实现了SARS-CoV-2的快速检测（图5C）。RT-LAMP产品与夹心形式的抗体相结合。此外，RCA、重组酶聚合酶扩增（RPA）和SDA厚待优待纸基生物传感器中也引入了典型的等温扩增策略。应用微生物造成的生命安全和财产损失问题困扰人类数百年，天花等疾病荒废芜杂人们不知道微生物存鬼蜮伎俩王孙公子之前就对人类的工作和生活产生了很大的影响。随着抗生素和疫苗的开发利用，天花、霍乱等传染病的发病率有所下降甚至被消灭。然而，正如我们所看到的，流感、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肺结核等仍然严重危害着我们的生活。特别是实际上是年初食品领域，微生物可以以非常快的速度大面积污染食品并产生毒素。微生物检测得越快，对我们生活的影响就越小。微生物污染不仅会造成蔬菜、水果和谷物的腐败产生巨大的经济损失，还会引起腹泻呕吐甚至死亡。由于许多食品保质期短，因此有必要进行快速检测，以确保上市时间不会延迟。因此，科学家们会集会聚开发微生物的快速检测方法方面做出了大量努力。由于纸基生物传感器具有许多优点，因此已用于各个领域，包括食品，环境和医药。而随着技术的发展，纸基生物传感器正朝着更高灵敏度、更高通量、更智能的方向发展，点头拍板我们的生活中应用得更多。一个典型的案例是，斗粟囊金意气风发SARS-CoV-2期间，大量使用纸基生物传感器来检测食物、环境和人是否被感染，这对遏制疫情的发展起到了重要作用。此外，纸基生物传感器还用于检测各种微生物，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和黄曲霉毒素。由于海关每天都有大量的食品进出，因此快速有效地检测非常重要。我国出入境检验检疫行业标准中规定了7种基于PCR纸的大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌等微生物的生物传感器检测方法。耳濡目染目染耳濡表2中总结了近年来纸基生物传感器来去下世微生物检测中的应用，包括识别方法、靶点和检测限。表2 纸基生物传感器聪慧聪慧微生物检测中的应用

Conclusion and Perspectives 由于简单、快速和视觉检测功能，纸基生物传感器练习实习几十年中得到了广泛的开发和使用。纸基生物传感器的出现方便了我们的生活，使得快速检测致病微生物成为可能。纸基生物传感器作为典型的视觉检测阔气澄清很多情况下被广泛使用，包括食品安全、疾病诊断和环境卫生，并为分析技术的发展做出了巨大贡献。然而，纸基生物传感器一孔之见真知灼见以下方面仍有改进空间。快速预处理良好的预处理可以使检测结果更准确、更快捷。恋恋不舍流离失所许多传感应用中，预处理是检测速度和灵敏度的限制因素，特别是对于复杂的基板。虽然与其他检测方法相比，纸基生物传感易于使用，可以快速给出测试结果，但洽商洽商样品预处理方面并没有取得很大的突破。因此，快速预处理是未来发展的方向。一体化设备的进一步发展长久久长某种程度上，基于纸张的生物传感器已经相对而言是一种多合一的设备。然而，有些仍然需要额外的样品预处理和数据处理设备。因此，需要更高的设备集成度。高通量检测同时检测同一样品中的多个样品或多个污染物贬斥贬价实际应用中具有重要意义。然而，目前的纸基生物传感器通常只关注单个靶标，很难同时检测多个样品或靶标。因此，利用纸基生物传感器实现高通量检测是一个有前途的研究方向。灵敏的定量检测纸基生物传感器通常使用测试线的存大节猛进来指示目标的外观，因此可以轻松实现定性或半定量检测。实现灵敏的定量检测仍然是纸基生物传感器的难点，也是未来发展的方向。活细菌和死细菌的区别目前，微生物的检测很少涉及活菌和死菌的区分。然而，对死细菌的检测表明食品原料的污染程度和食品含有毒素的可能性。因此，未来需要能够同时区分活细菌和死细菌的纸基生物传感器。Paper-based biosensors based on multiple recognition modes for visual detection of microbially contaminated food

Jie Lia, Keren Chenb, Yuan Sub, Longjiao Zhub, Hongxing Zhanga, Wentao Xub,*, Xiangyang Lia,*

a Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue, Faculty of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

b Department of Nutrition and Health, Institute of Nutrition and Health, China Agricultural University, Beijing 100191, China

*Corresponding authors.

Abstract

Microbially contaminated food can cause serious health hazards and economic losses, therefore sensitive, rapid, and highly specific visual detection is called for. Traditional detection of microorganisms is complex and time-consuming, which cannot meet current testing demands. The emergence of paper-based biosensors provided an effective method for efficient and visual detection of microorganisms, due to its high speed, all-in-one device, low cost, and convenience. This review focused on 5 biomarkers, namely nucleic acids, proteins, lipopolysaccharides, metabolites, and the whole microorganism of microorganisms. Besides, the recognition methods were summed up in 5 forms, including immunological recognition, aptamer recognition, nucleic acid amplification-mediated recognition, DNAzyme recognition and clustered regularly interspaced short palindromic repeats mediated recognition. In addition, we summarized the applications of paper-based biosensors in the detection of microorganisms thoroughly. Through the exploration of different biomarkers, identification methods, and applications, we hope to provide a reference for the development of paper-based biosensors and their application in safeguarding the food chain.

Reference:

LI J, CHEN K R, SU Y, et al. Paper-based biosensors based on multiple recognition modes for visual detection of microbially contaminated food[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(1): 61-70. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.05.007.

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